جداسازی و کلونینگ ژن آلفا-آمیلاز باکتری باسیلوس سابتیلیس dr8806 درbl21 e. coli

در این پژوهش، ژن آلفا-آمیلاز سویه گرمادوست bacillus subtilis dr8806 از چشمه دیگ رستم، با استفاده از آغازگرهای لینکردار حاوی جایگاه های برشی bamhi و hindiii جداسازی شد. ژن amy88 با اندازه 2004 جفت باز، به منظور همسانه‏سازی و تعیین توالی در حامل ptz57r/t جاگذاری و در باکتری escherichia coli dh5? کلون گردید. با استفاده از روش کلونی pcr و هضم آنزیمی حضور ژن هدف در ناقل مربوطه تأیید شد.جاگذاری ژن آلفا-آمیلاز درون ناقل بیانی pet28a(+) برش خورده انجام شد وسازه نوترکیب به میزبان e.coli bl21(de3) انتقال یافت. بیان ژن آلفا-آمیلاز تحت کنترل پروموتر t7توسط القاگر iptg با غلظت نهایی 1میلی‏مولاردر دمای c° 25 انجام شد.آنزیم نوترکیب دارای برچسب 6xhis-tag در انتهای آمین با کروماتوگرافی تمایلی ni2+-nta تخلیص شد. ضریب خالص سازی‏ آنزیمبا فعالیت ویژهu/mg 3272، برابر با20 بود. بر اساس sds-page، وزن مولکولی آنزیم آمیلاز 76 کیلودالتون تخمین زده شد.آنزیم نوترکیب با حداکثر فعالیت در 5 ph و دمای °c 70 و نیمه عمر 125 دقیقه، در گستره وسیعی از ph و دما فعال بود. فعالیت آمیلاز گرمادوست در حضور یون‏های سدیم، پتاسیم و کلسیم افزایش یافت، اما یون های روی، سرب و جیوه سبب مهار فعالیت آنزیم شدند. افزون بر این، آمیلاز پایداری بالایی را در برابر sds و اوره در غلظت های 1 و 5 میلی مولار نشان داد. نتایج، پایداری و افزایش فعالیت آنزیم در حضور حلال های آلی را نشان داد. پس از انکوباسیون آنزیم در حضور مایعات یونی بر پایه ایمیدازول، بیشترین فعالیت باقی مانده در مایع یونی 1-بوتیل 3- متیل ایمیدازولیوم کلراید مشاهده شد. با توجه به ویژگی هایی مانند پایداری حرارتی بالا، فعالیت در ph اسیدی و مقاومت به حلال های آلی، آنزیم ?- آمیلاز نوترکیب dr8806می تواند گزینه ای مناسب برای کاربردهای صنعتی به ویژه در صنایع غذایی باشد.